Get Adobe Flash player

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ СПЕКТРА ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ОБРАЗЦОВ НАТИВНОГО ОЧИЩЕННОГО ДИФТЕРИЙНОГО АНАТОКСИНА

Автор: И. В. Елисеева, А. О. Дорошенко, Е. М. Бабич, Л. А. Ждамарова, В. И. Белозерский, Т. В. Горбач

Страницы: 680–689

Аннотация

Функциональные свойства белков определяются их конформационной структурой, которая стабилизируется двумя классами сильных и тремя классами слабых связей. Дифтерийный токсин – это белковая молекула, состоящая из двух взаимно независимых глобулярных доменов А и В, соединенных вместе дисульфидными мостиками. Детоксикация дифтерийного токсина есть процесс разрушения его нативной трехмерной структуры под воздействием формальдегида и высокой температуры. Известны прецеденты реверсии токсичности анатоксина. В соответствии с действующими правилами национальных органов, не существует никаких конкретных требований для проверки этой возможности. Таким образом, существует необходимость привлечения специальных методов тестирования. В изучении структуры, динамики и функции нуклеиновых кислот и белков широко используется флуориметрия. Считается, что изменения интенсивности свечения и местоположения максимумов флуоресценции может указывать на действие какого-либо фактора как причины нарушения пространственной конфигурации белка и изменения биологических свойств белка, как следствия. Целью исследования стало определение спектров флуоресценции различных серий нативного очищенного дифтерийного анатоксина (НОДА). Была проведена флуориметрия четырех образцов НОДА, изготовленных на предприятии ОАО «Фармстандарт-Биолек», с использованием флуориметра Hitachi 850. Максимумы флуоресценции во всех исследованных образцах находились в диапазоне между 330 и 345 нм, характерном для флуоресценции белков. Не выявлено очевидного влияния содержания белка в препарате на интенсивность его флуоресценции. Максимальный пик флуоресценции обнаружен в старейшем образце № 1 от 2007 года (395 условных единиц), минимальный уровень – в образце № 4, произведенном в 2015 году (266 условных единиц). Из данных литературы известно, что интенсивность флуоресценции неочищенных образцов дифтериного анатоксина в процессе и сразу после детоксификации была на порядок ниже полученных нами показателей интенсивности свечения НОДА: от 12 до 26 условных единиц, тогда как нативный дифтерийный токсин характеризовался еще более низким уровнем свечения: от 2 до 9 условных единиц. Очевидно, что в процессе трансформации дифтерийного токсина в анатоксин и дальнейшего его хранения в белковых молекулах происходят денатурационные процессы, которые проявляются в разрыхлении белковых глобул, высвобождении остатков триптофана, что повышает интенсивность флуоресцентного свечения. Степень денатурации безусловно связана с уровнем специфической (иммуногенной) активности образца дифтерийного анатоксина. Так что если активность сохраняется, то вероятно речь идет о первой стадии денатурации – функциональном переходе в пределах нативной структуры белка. При полном развертывании аминокислотной белковой цепочки активность дифтерийного анатоксина очевидно теряется, на что может указывать относительное повышение уровня свечения образцов НОДА. В случае необъяснимого тушения флуоресценции образца дифтерийного анатоксина можно предположить возможность реверсии его токсичности. Приведенные данные свидетельствуют о том, что флуориметрия может быть использована для мониторинга конформационных изменений образцов дифтерийного анатоксина и стать орудием для регуляции контроля качества вакцины путем внедрения в производство демонстрации динамики спектров флуоресценции. Скрининг спектров флуоресценции наработанных производственных образцов анатоксина в процессе их хранения может помочь выявлению серий, качество которых вызывает сомнения.

Ключевые слова: дифтерийный анатоксин, флуориметрия, гашение флуоресценции, денатурация белка, конформационные изменения. 

Этот адрес электронной почты защищен от спам-ботов. У вас должен быть включен JavaScript для просмотра.

Список литературы

  1. Middlebrook JL, Dorland RB. [Bacterial toxins: Cellular Mechanisms of Action] Microbiological Reviews. 1984; Sept.:199–221.
  2. Zhukova YаF, Dzhedzhula GG, Radavs'kij YuL. Strukturno-funkcіonal'na organіzacіya difterіjnogo toksinu [Structural and functional organization of diphtheria toxin] Mіkrobіol. zhurn.1997;59(3):91–101.
  3. Collier RJ. [Diphtheria toxin: Mode of action and structure] Bacteriol. Rev. 1975;39:54–85.
  4. Dawson R, Elliot D, Elliot W, Jones K. Spravochnik biohimika [Biochemist Handbook], Moscow: Mir Publ., 1991. 556 p.
  5. Stainer DW, Cameron J. [Irreversibility of toxoids. An improved method of testing] Dev Biol Stand. 1977;34:149–153.
  6. Akama K, Ito A, Yamamoto A, Sadahiro S. [Reversion of toxicity of tetanus toxoid] Jpn J Med Sci Biol. 1971 Jun;24(3):181-183.
  7. Kudryashova EV, Gladilin AK, Levashov AV. Belki v nadmolekulyarnyh ansamblyah: issledovanie struktury metodom razreshenno-vremennoj fluorescentnoj anizotropii. [Proteins in supramolecular ensembles: a study of the structure of the method of allowed-time fluorescence anisotropy] Uspekhi biologicheskoj himii.2002;42:257–294.
  8. Vlasova IM, ZHuravleva VV, Saleckij AM. Inducirobannaya dodecilsul'fatom natriya denaturaciya bych'ego syvorotochnogo al'bumina po dannym triptofanovoj fluorescencii belka [Induced SDS denaturation of bovine serum albumin according tryptophan fluorescence protein] Himicheskaya fizika.2014; 33( 5):69–75.
  9. Burstein EA, Abornev SM, Reshetnyak YK.[Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms] Biophys J. 2001;81(3):1699–1709.
  10. Babich YM, Posohov YO, Kalіnіchenko SV, Rizhkova TA, Sklyar NІ, Antusheva TІ, Bіlozers'kij VІ, Eglіt VO Sposіb kontrolyu detoksikacіi toksinіv difterіi [Control method of detoxification of diphtheria toxin] Ukrainian patent, no 80581, 2013.
  11. Braun LJ, Tyagi A, Perkins S, Carpenter J, Sylvester D, Guy M, Kristensen D, Chen D. [Development of a freeze-stable formulation for vaccines containing aluminum salt adjuvants] Vaccine. 2009; Jan.:1;27(1):72-9.
  12. Régnier M1, Metz B, Tilstra W, Hendriksen C, Jiskoot W, Norde W, Kersten G. [Structural perturbation of diphtheria toxoid upon adsorption to aluminium hydroxide adjuvant] Vaccine. 2012 Nov 6;30(48):6783-8.

Copyright ,

Журнал клiнiчних та експериментальних медичних дослiджень © 2013. 

All Rights Reserved.